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  • 发布时间:2019-07-02
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简介 His蛋白纯化方案稀释表达的大肠杆菌(:),摄氏度振荡直至OD=(用ml烧瓶,内含ml培养液)加IPTG(mM),振荡小时离心大肠杆菌,r,min,冷冻颗粒在冰上使用ml裂解缓冲液(Trito

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His蛋白纯化方案稀释表达的大肠杆菌(:),摄氏度振荡直至OD=(用ml烧瓶,内含ml培养液)加IPTG(mM),振荡小时离心大肠杆菌,r,min,冷冻颗粒在冰上使用ml裂解缓冲液(Triton)裂解细胞在冰上超声处理秒每次,次离心细胞提取物,r,摄氏度离心分钟(蛋白质在上清液)GSTpulldown,将ul细胞提取物加入到ulGST珠或GSTnsp珠中同时,ul细胞提取物加入ulxSDS样品缓冲液作为INPUT,剩余在摄氏度保存GSTpulldown方案进行SDSPAGE凝胶来计算GST蛋白(阴性对照)和GSTnsp蛋白的体积比(它们应为:,GST,kd)GST:ulnsp:ul首先制备μl对照珠,在冰上(μl次)用×TBS洗涤珠两次准备个管用于GST蛋白(ul管)和个管用于GST完全nsp蛋白(ul管),加入ul对照珠,然后加入ulHis标签全长N蛋白,T和T蛋白。 摄氏度翻滚小时。

℃r离心,去除细胞提取液。 在冰上(μl次)用GST裂解缓冲液(Triton,不含PMSF)冲洗完全抑制剂片剂、溶菌酶和珠子次。

在冰上用μl冷TBS将珠子洗涤次,用注射器除去所有上清液,每管加入μl×SDS样品缓冲液,煮沸。 SDSPAGE凝胶,包括INPUT(ul),GSTTAGpulldown(ul),GSTnsppulldown(ul)。 使用抗His做蛋白质免疫印迹。 裂解缓冲液:×PBS甘油TritonmMDTTmgml溶菌酶(mgml储备液,Franzi)mMPMSF(摄氏度,mM储备液)完全抑制剂片(摄氏度,片加μlPBS,×储备液)。